Проект РНФ 25-19-00872 (2025-2027) «Разработка и исследование микрофлюидного устройства («Легкое на чипе») с использованием микрофлюидных, акусто- и радиоэлектронных технологий для моделирования на клеточном уровне физиологической микросреды дыхательных путей и тестирования лекарственных препаратов in vitro.» Руководитель д.ф.-м.н. Кузнецова И.Е.

2025 год

1. В ходе выполнения работ с использованием аддитивных технологий были изготовлены образцы микрофлюидных ячеек из биосовместимых полимеров полидиметилсилоксан (ПДМС), полиметилметакрилата (ПММА) и поликарбоната. В ходе проведения испытаний ячеек было выявлено, что наиболее перспективной для дальнейшего использования является ячейка, изготовленная методом фотополимерной печати из ПММА. Это обусловлено минимальными размерами каналов, простотой ее разбора и герметичностью, сравнимой с образцом ячейки из ПДМС.
2. В ходе выполнения запланированных работ был проведен подбор и характеризация пористых мембран для дальнейшего использования в качестве основы при выращивании слоев эпителиальных клеток. В результате были подобраны и охарактеризованы пористые гибкие мембраны из поликапролактона, поливинилиденфторида и ацетата целлюлозы. Методом электронной микроскопии была проанализирована морфология их поверхности. Наиболее перспективным материалом для изготовления мембран является ПКЛ, модифицированный спидроином, что связано с его высокой биосовместимостью и эластичностью мембраны. Исследованные материалы будут использованы в качестве основы при выращивании слоев эпителиальных клеток, размещаемых в созданной микрофлюидной ячейке.
3. Для анализа эффективности иммобилизации эпителиальных клеток Caco-2 на различные пористые мембраны были исследованы мембраны из рекомбинантного спидроина с добавлением поликапролактана (ПКЛ), полиэтилентетрафталат (ПЭТФ), ацетилцеллюлозы и ПВДФ. В результате было установлено, что для получения однородного клеточного слоя подходят мембраны из полиуретана и ПКЛ с добавлением спидроина.
4. В ходе выполнения запланированных работ было проведено исследование процесса роста эпителиальных клеточных линий CaCo-2, A549, NCI-H441 в условиях нормоксии и гипоксии на пористых мембранах на основе поликапролактона с добавлением спидроина. В результате был изучен процесс роста эпителиальных клеточных линий Caco-2, A549, NCI-H441 в условиях нормоксии и гипоксии методами конфокальной лазерной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и РАМАН спектроскопии. Наиболее перспективным методом контроля роста клеточных слоёв является конфокальная лазерная микроскопия, поскольку она обеспечивает неинвазивное наблюдение структуры клеток в реальном времени. Комбинирование этого метода с РАМАН спектроскопией позволяет не только подтвердить наличие клеточного слоя, но и оценить его метаболическую активность. Методы сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии обеспечивают наиболее полное описание морфологии и свойств поверхности клеточных слоёв. Однако их существенным ограничением является необходимость предварительной фиксации и сушки образцов, что приводит к утрате клеточной активности и исключает возможность дальнейших наблюдений in vitro.
5. В ходе выполнения запланированных работ были изучены механические свойства мембран из поликапролактона с молекулярной массой 35 кДа, 65 кДа и 100 кДа с добавлением спидроина. Было проведено исследование размеров и модуля Юнга отдельных волокон мембран. Средние значения размеров волокон составили 70 нм, 77 нм и 110 нм, а среднее значение модуля Юнга волокна составило 1.25 МПа, 1.5 МПа и 3.3 МПа для ПКЛ мембран с вышеуказанной молекулярной массой, соответственно. В результате выполнения запланированных работ были исследованы механические свойства используемых мембран с целью имитации эффекта «дыхания» в двухкамерной микрофлюидной ячейке. Установлено, что оптимальными упругими свойствами обладает мембрана, полученная на основе поликапролактона с молекулярной массой 100 кДа. Найдены параметры, при которых можно добиться периодического изменения площади поверхности мембраны на 15%, т.е. имитировать «дыхание» мембраны.
6. В ходе выполнения работ разрабатывался измерительный стенд для обеспечения измерений при различных течениях жидкостей в микрофлюидном устройстве. В результате был создан измерительный стенд для обеспечения и измерения различных режимов течения жидкостей в микрофлюидных устройствах. Этот стенд позволяет имитировать дыхание клеточного слоя, находящегося на полупроницаемой гибкой мембране, монтированной в микрофлюидном устройстве. Скорость подачи жидкости в отделения микрофлюидного устройства может настраиваться в широком диапазоне величин. Также созданный стенд позволяет проводить измерения электрофизических характеристик клеточного слоя с помощью подключенного внешнего потенциостата-гальваностата.
7. Наиболее распространенными методами стерилизации многоразовых устройств в биотехнологиях являются автоклавирование, стерилизация сухим жаром, ультрафиолетовое (УФ) облучение, химическая стерилизация. В данном разделе проводилась оптимизация методов стерилизации созданной микрофлюидной ячейки, учитывающих необходимость соблюдения температурного режима из за использования биосовместимых полимеров. В результате выполнения работ было установлено, что оптимальным способом стерилизации микрофлюидной ячейки является двухэтапная стерилизация компонентов ячейки в 95% растворе этилового спирта и последующая обработка собранной ячейки в плазменном стерилизаторе Sterrad при температуре 120°C в течение 2х часов.